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协合医院细胞培养--液氮贮存桶

发布时间：2017/12/28 18:15:59    关注量：1370
细胞培养的一般过程，主要包括准备、取材、培养和冻存复苏4步。为保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。  
冻存的温度一般用一196℃液氮温度，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。  
目前美国标准细胞库或细胞银行，其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。  
1．目的：  
为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。  
2．适用范围：  
适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。  
3．操作规程：  
3.1  培养液、PBS、胰蛋白酶的配制  
3.1.1   1000ml培养液的配制  
1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。紫外线照台30min。  
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。  
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。  
4、用1M（1mol/L）HCl调PH至7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4生长，配制好后PH值会升高0.2～0.3，故配时调PH至7.0左右）。  
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。  
6、配青霉素80万/瓶+4ml蒸馏水溶解  
配链霉素100万/瓶+4ml蒸馏水溶解  
取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。  
7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。  
注意：  
（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。  
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。  
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗  
水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。  
3.1.2PBS（平衡盐溶液）的配制  
NaCl8g  
KCl0.2g＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ml  
Na2HPO4*H2O1.56g  
KH2PO40.2g  
3.2细胞复苏  
1、准备：紫外线照台30min，准备好装有高压灭菌好的吸管、试管的饭盒、废液缸；培养基临用前放水浴箱里温育20分钟。在操作台上摆放好物品，左边为饭盒、培养液等，中间为酒精灯、试管架等，右边放滴管架、镊子，右上角放废液缸。  
2、灼烧培养瓶口及瓶盖，用滴管取培养基5ml加入试管中（一滴约为50ul）。  
3、戴手套，从-196℃液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速解冻，同时不断轻轻摇动冻存管，保证冻存管内细胞1min内融化。以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（慢冻快融）  
4、用吸细胞液的滴管从冻存管中完全吸出细胞悬液，加入到已装有培养基的试管中，塞子塞试管，800rpm离心2min（用培养基且离心的目的:去除细胞冷冻保护剂DMSO，因常温下其对细胞毒性大），弃上清，试管底部的白色物质为细胞，轻弹混匀。往试管中加培养基、FBS（胎牛血清）各80滴和20滴（使FBS浓度为20％）。用吸细胞液的滴管轻轻吹打，使细胞混匀，以免在培养瓶里成团，影响细胞生长。  
5、将试管中的细胞悬液用吸细胞液的滴管全部吸出，加到培养瓶中，标记日期、细胞名称，再把培养瓶放入CO2培养箱。（注意：加入到培养瓶后，培养瓶轻轻平放，用手拿培养瓶侧壁，左右上下轻轻摇晃几次，使细胞均匀贴壁在培养瓶底。）  
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。  
注意：  
（1）入细胞室前观察CO2%压力，5-7.5mPa左右，减压器表压力不低于0.1mPa！  
（2）刚复苏的细胞需要的营养成分更多些，让FBS浓度达到20％。  
（3）离心时间为1～2min，速度为800转，不要离心太久，避免对细胞伤害较大。  
（4）滴管使用注意事项：  
a.吸细胞液专用一个滴管，各株细胞的滴管一定要严格分开，不能混用，防止细胞间污染。  
b.培养基和FBS（胎牛血清）可以用一个滴管，但分开用更好！  
c.FBS（胎牛血清）不能和胰酶用一根滴管,因为血清对胰酶活性有抑制作用。  
d．胰酶和PBS（平衡盐溶液）可以用一根滴管，不过最好分开  
（5）不是所有的细胞复苏后都能活。死亡原因：冻存时间太长（如2年以上），技术不过关（如吹打太激烈）、细胞传代数太多等。  
（6）关于PBS（平衡盐溶液）:  
a.PBS溶液配好后要高压灭菌后才能用；PBS高压时其瓶塞一定要插针头。  
b.PBS和培养基都可以冲洗培养瓶里细胞中的杂质，但需用温过的PBS冲洗细胞中的杂质。PBS虽然冲洗杂质效果较好，但它有使细胞易脱壁的倾向，故不可经常冲洗细胞。  
c．不温的PBS用来做难消化细胞消化前冲洗一遍的准备，使细胞加入胰酶后易消化。  
d．消化后暂时不养细胞的培养瓶，可以往其中加入2～3mlPBS（防止培养瓶干燥），培养瓶放CO2培养箱里短时间保存。下次用该培养瓶再养同种细胞时，把PBS吸出弃去，再用培养基冲洗一遍即可再用。  
（7）DMSO（二甲基亚砜）在常温下对细胞毒性较大，而在4℃时，其毒性大大减弱，故冻存的细胞复苏后应及时洗涤冷冻保护剂DMSO（离心后弃去上清），防止DMSO在常温下对细胞产生较大毒性！  
3.3细胞换液  
1、倒置显微镜下观察细胞生长状态：  
a.移动细胞培养瓶时，观察到呈漂浮状态的细胞为死细胞；  
b.生长状态良好的细胞：透明度大、折光性强、轮廓不清；能看清部分细胞细微结构，细胞处于对数生长期时可以见到很多分裂期细胞。  
c.生长状态不良的细胞:细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴、颗粒样物质，细胞间空隙加大，细胞变得不规则，失去原有特点。  
d.只有生长状态良好的细胞才适合进一步传代和实验。  
2、紫外线照台30min，准备好吸管、试管饭盒，温育培养基，FBS（胎牛血清）可不温。实验开始时打开照明灯和抽风机，用75%酒精喷双手。酒精灯点燃放中间。滴管放滴管架上，从左到右顺序为：吸细胞液的滴管、吸培养基的滴管、吸FBS（胎牛血清）的滴管。从水浴箱中取出培养基，擦干水放入操作台的左边。  
3、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，在酒精灯外焰上旋转灼烧其瓶口、盖子处（注意不要把胶盖烧焦），滴管（前端90%部位）灼烧。细胞培养瓶倾斜，用吸细胞液的滴管吸出旧液弃到废液碗中，尽量吸干净。注意：滴管的胶头应在瓶外压紧再伸进培养瓶内，避免产生气泡，且不要伸入瓶内太多，防止造成污染；滴管尖端悬空弃液，不要触到废液碗（要亲眼看到弃液，防止滴管尖端触到废液碗）！  
4、用吸培养基的滴管吸取培养基90滴加入到培养瓶（25c㎡）中，再用吸FBS（胎牛血清）的滴管吸取FBS10滴加入到培养瓶中。（使FBS浓度为10％）  
5、旋紧细胞培养瓶盖后，再旋回半圈，以利于空气流通。平放回CO2培养箱中。  
6、收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台，擦台，保持台面整洁。  
注意:  
（1）在打开培养基、FBS（胎牛血清）、培养瓶前后均需旋转灼烧其瓶口和瓶盖，严格注意无菌操作。灭菌饭盒只能在无菌操作台里打开。  
（2）镊子每次使用前均需灼烧。装FBS的瓶子瓶盖小，用镊子夹住盖子灼烧后，再用其夹住瓶盖盖上；取其瓶盖时也是用镊子夹住瓶盖取下盖子。  
（3）滴管在第一次使用前也需灼烧。注意：除吸取细胞液的滴管外，其他滴管滴加液体时都要悬空滴加。已吸过液体的滴管在再次使用前决不能再灼烧！滴管千万不能混用！  
（4）培养瓶口不要对着自己，不加试剂时要平放。  
（5）培养液以没过细胞为宜。  
（6）细胞液颜色变黄，死细胞多时换液。不要求每天换液，容易增加污染机会。
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